苯并咪唑類藥物殘留分析技術(shù)——水解方法

時間：2023-03-24 22:43:52來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物殘留分析技術(shù)——水解方法

[db:作者] / 2022-12-22 00:00

17.1.4 殘留分析技術(shù)

17.1.4.1 前處理方法

藥物殘留檢測方法建立過程中前處理方法至關(guān)重要，樣品凈化的好壞不僅直接影響到方法的靈敏度和回收率，而且影響整個分析方法的用時和工作量。一般樣品前處理過程包括提取和凈化兩個環(huán)節(jié)。BMZs屬于弱堿性，在堿性條件下易溶于有機(jī)溶劑，所以對于常規(guī)的檢測方法，樣品前處理過程經(jīng)常采用堿化的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，經(jīng)過正己烷除脂凈化，然后過固相萃取柱再凈化，此外也有使用離子對、基質(zhì)固相分散技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)進(jìn)行萃取凈化的報道。

(1) 水解方法

水解是為了讓與蛋白或共軛物上結(jié)合的BMZs殘留物釋放出來，或者使其變成其通常的分子結(jié)構(gòu)。在BMZs殘留分析中，絕大多數(shù)都采用了水解軛合物步驟。水解方法主要包括酶水解和酸水解等。酶水解時間較長，一般需過夜；酸水解加熱數(shù)小時即可水解完全。

1)酶水解

酶水解通常將酶加到樣品中，混勻，置于37℃水浴鍋或搖床.上，緩慢震蕩過夜酶解，然后再進(jìn)行提取。依據(jù)不同的組織樣品，常用的酶有β-葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶和蛋白酶等。酶解的操作比較簡單，只是對溫度有要求，一般需要過夜酶解，耗時較長。

Chuckwudebe等對蛋雞和泌乳羊體內(nèi)TBZ的代謝進(jìn)行了詳細(xì)研究。采用酶解的方法，發(fā)現(xiàn)排泄物、蛋、奶及其他可食用組織中TBZ軛合物主要以硫酸鹽的形式存在。蝸牛酶水解法在0.1mol/L pH5的醋酸鈉緩沖液中進(jìn)行，硫酸酯酶水解法在0.05mol/L pH7的Tris緩沖液中進(jìn)行，β-葡萄糖醛酸酶水解法在0.5mol/L pH7的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行。TBZ的代謝物TBZ-5-OH鄰硫酸鹽是在無β-葡萄糖醛酸酶的情況下，由其他兩種酶水解而來。Vandenheuvel等在藍(lán)腮太陽魚研究中采用酶解的方法把TBZ-5-OH從軛合物中解離出來。用蝸牛酶和硫酸酯酶活性比為13.5：1，加入每個樣品中，再加入一滴甲苯，37℃孵育過夜，然后將樣品加熱到60℃維持5min，用0.1mol/L乙酸鈉溶液調(diào)至pH6.3，然后用乙酸乙酯提取魚可食組織和內(nèi)臟中的藥物，兩種組織中藥物的回收率基本相同，均大于90%。Tocco等發(fā)現(xiàn)尿中TBZ代謝物主要以葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH的形式存在。因此，軛合物通常采用β-葡萄糖醛酸酶或葡萄糖苷酶水解方法，將1000單位的β-葡萄糖醛酸酶溶解到10mL pH6.5的索倫森緩沖液中，37℃孵育18h，再用乙酸乙酯提取水相中的TBZ-5-OH。酶解法證明了TBZ分子上一定有糖部分。Caprioli等采用蛋白酶對牛肝臟組織進(jìn)行酶解。5g牛肝組織勻漿加15mL pH 3.0的磷酸緩沖液，然后再加1.5mL蛋白酶渦動混勻，用鹽酸調(diào)至pH3.78，37℃過夜酶解。從結(jié)果來看，對于牛肝添加樣品，酶解方法的回收率普遍沒有不酶解的方法高。對于阿苯達(dá)唑等14種BMZs藥物和代謝物中只有TBZ-5-OH的回收率為98%，大于沒有酶解方法的95%；其余藥物的回收率都沒有不酶解方法的高，當(dāng)然該方法的提取溶劑與不酶解的不同，所以對于酶解效果很難進(jìn)行比較。

2) 酸水解

與酶水解相比，酸水解往往需要較高的溫度(80～100℃)，但酸解的時間較短，一般約需數(shù)小時。許多殘留檢測方法都采用了酸解方法。

Markus等提取肝臟組織中ABZ代謝物時，采用酸解的方法使組織中的代謝物轉(zhuǎn)化成ABZ-NH2-SO2。采用6mol/LHCl在110℃±4℃，15psi大氣壓下水解30min，1h后取出樣品，室溫冷卻約5min。此方法回收率為101.7%±5.2%。Arenas等將5mL奶樣用濃鹽酸在85～90℃酸解4h，釋放出與硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH，酸解物用NaOH中和并調(diào)節(jié)pH至8.0，然后用乙酸乙酯提取，提取物用PRS陽離子交換柱凈化，高效液相色譜(HPLC)檢測。TBZ、TBZ-5-OH和與硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH回收率分別大于87%、98%和96%。Tocco等也采用6mol/L HCI回餾1h，水解尿中硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH，中和至pH6.0，然后再用乙酸乙酯提取。Chu等用阿苯達(dá)唑主要代謝產(chǎn)物ABZ-NH2-SO2作為殘留標(biāo)示物，建立了檢測奶中ABZ代謝物殘留的方法。奶樣加磷酸于100℃水解1h，接著用SCX SPE柱凈化。在這個過程中，酸解使ABZ-NH2-SO2游離出來。用反相HPLC定量檢測殘留標(biāo)示物。該方法適用于ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO和ABZ-NH2-SO2結(jié)合物的檢測，但不適用于ABZ、NETO或ABZ-SO的檢測。結(jié)果顯示，該方法能夠檢測奶牛給藥后36～120h內(nèi)奶中大于40%的ABZ殘留；添加水平為25～200ng/mL時的回收率在91%～105%之間，重復(fù)分析試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%。

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